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普諾賽細(xì)胞學(xué)堂 | 細(xì)胞轉(zhuǎn)染條件優(yōu)化“四部曲”,從此告別低效!

更新時(shí)間:2025-06-26  |  點(diǎn)擊率:716

 

細(xì)胞轉(zhuǎn)染是一種廣泛使用的實(shí)驗(yàn)室技術(shù),通過(guò)將外源核酸(如DNA、mRNA、siRNA等)導(dǎo)入到受體細(xì)胞中,在基因功能研究、疾病模型構(gòu)建、蛋白表達(dá)及藥物開(kāi)發(fā)等領(lǐng)域發(fā)揮著關(guān)鍵作用。然而,由于不同來(lái)源的細(xì)胞具有不同的生理特性,它們對(duì)轉(zhuǎn)染條件的敏感性存在顯著差異,導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率參差不齊。因此,如何有效提升這一效率已成為科研工作者面臨的重要挑戰(zhàn)。

 

 

 

本期細(xì)胞學(xué)堂將分享四個(gè)關(guān)鍵優(yōu)化步驟,助您輕松提高轉(zhuǎn)染效率!

01#

選擇適合的轉(zhuǎn)染方法

常見(jiàn)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法包括化學(xué)法、物理法和病毒載體法[1]。

化學(xué)法

化學(xué)法包括脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、DEAE-葡聚糖法、陽(yáng)離子聚合物轉(zhuǎn)染法等。其原理是利用轉(zhuǎn)染試劑(如陽(yáng)離子脂質(zhì)體、DEAE-葡聚糖、陽(yáng)離子聚合物等)與帶負(fù)電荷的核酸形成復(fù)合物,并通過(guò)內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞,從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞轉(zhuǎn)染?;瘜W(xué)轉(zhuǎn)染法具有操作簡(jiǎn)便、適用范圍廣等優(yōu)點(diǎn),但也存在一定的細(xì)胞毒性[2-4]。因此,針對(duì)不同的細(xì)胞類(lèi)型,選擇適合的轉(zhuǎn)染試劑對(duì)轉(zhuǎn)染效果具有決定性影響。

物理法

物理法包括顯微注射法、電穿孔法等[5]。其中,電穿孔方法是利用高壓電流脈沖在細(xì)胞膜上形成瞬時(shí)微孔,使核酸等生物分子進(jìn)入細(xì)胞。該方法轉(zhuǎn)染效率高,但對(duì)細(xì)胞的損傷較大,細(xì)胞致死率高。

病毒載體法

病毒載體法,如慢病毒、腺病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒。尤其是,慢病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒可以將基因組整合到宿主細(xì)胞中,實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定且長(zhǎng)期的基因表達(dá)[6]。然而,病毒載體法存在細(xì)胞毒性和潛在的生物安全風(fēng)險(xiǎn),需要嚴(yán)格的操作規(guī)范。

根據(jù)細(xì)胞類(lèi)型和實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇合適的轉(zhuǎn)染方法至關(guān)重要。對(duì)于大多數(shù)貼壁細(xì)胞,脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染是一種常用且較為溫和的方法;而對(duì)于原代細(xì)胞或難轉(zhuǎn)染的懸浮細(xì)胞,電穿孔或病毒載體轉(zhuǎn)染可能更為合適。

 

02#

優(yōu)化細(xì)胞密度

細(xì)胞密度是影響轉(zhuǎn)染效率的重要因素之一。

一般來(lái)說(shuō),貼壁細(xì)胞在70%-90%匯合度時(shí)轉(zhuǎn)染效果較好。然而,對(duì)于某些特殊的細(xì)胞系或轉(zhuǎn)染方法,可能需要調(diào)整細(xì)胞密度。建議在轉(zhuǎn)染前一天設(shè)置多個(gè)細(xì)胞密度梯度進(jìn)行接種,以便在轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí)達(dá)到不同的匯合度。轉(zhuǎn)染后,通過(guò)實(shí)驗(yàn)評(píng)估各組的轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞狀態(tài),以確定細(xì)胞密度范圍。

03#

優(yōu)化待轉(zhuǎn)物濃度與轉(zhuǎn)染試劑比例

以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染為例,脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑和待轉(zhuǎn)物的比例不同,對(duì)轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞毒性有顯著影響。

為了優(yōu)化轉(zhuǎn)染效果,建議在細(xì)胞消化接種到孔板時(shí),每孔加入等量的細(xì)胞懸液,以確保轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度的一致性。根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)推薦比例,設(shè)置梯度,如轉(zhuǎn)染試劑:待轉(zhuǎn)物比例分別為1:1、2:1、3:1,制備不同濃度的轉(zhuǎn)染復(fù)合物,分別加入到相應(yīng)的孔中,每個(gè)比例設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔以確保數(shù)據(jù)的可靠性。將培養(yǎng)板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育一定時(shí)間后,通過(guò)熒光顯微鏡觀察或流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率,并用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選擇轉(zhuǎn)染效率高且細(xì)胞毒性低的比例,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

04#

優(yōu)化孵育時(shí)間

轉(zhuǎn)染后細(xì)胞與轉(zhuǎn)染復(fù)合物的孵育時(shí)間是影響轉(zhuǎn)染效果的重要因素之一。

孵育時(shí)間過(guò)短可能導(dǎo)致轉(zhuǎn)染復(fù)合物未能充分進(jìn)入細(xì)胞,導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率低;而孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則可能增加轉(zhuǎn)染試劑對(duì)細(xì)胞的毒性,影響細(xì)胞狀態(tài)。為了優(yōu)化轉(zhuǎn)染效果,建議在轉(zhuǎn)染后設(shè)置多個(gè)時(shí)間點(diǎn)(如6 h、12 h、24 h等)更換培養(yǎng)基,并觀察轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞毒性變化。對(duì)于一些對(duì)轉(zhuǎn)染試劑較為敏感的細(xì)胞,縮短孵育時(shí)間可能有助于降低細(xì)胞損傷,同時(shí)保持較高的轉(zhuǎn)染效率。通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定孵育時(shí)間,以實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)染效果和細(xì)胞活性的平衡。在完成一系列優(yōu)化實(shí)驗(yàn)后,需對(duì)結(jié)果進(jìn)行系統(tǒng)總結(jié)。對(duì)比不同條件下轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞存活率的數(shù)據(jù),分析各參數(shù)對(duì)轉(zhuǎn)染效果的影響。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,總結(jié)出適用于特定細(xì)胞系或?qū)嶒?yàn)體系的轉(zhuǎn)染條件優(yōu)化策略,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供參考依據(jù)。

 

 

 

案例分享:

Hep G2細(xì)胞轉(zhuǎn)染條件優(yōu)化

 

實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)

為了確定人肝癌細(xì)胞Hep G2的最佳轉(zhuǎn)染條件,本研究將綠色熒光蛋白基因(EGFP)通過(guò)不同轉(zhuǎn)染條件導(dǎo)入Hep G2,并觀察其表達(dá)情況。

預(yù)實(shí)驗(yàn)

在預(yù)實(shí)驗(yàn)階段,我們選擇了一種常規(guī)的轉(zhuǎn)染試劑,嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作。但轉(zhuǎn)染效率非常低,不到10%的細(xì)胞表達(dá)了熒光蛋白。

優(yōu)化策略

為了提高轉(zhuǎn)染效率,我們從以下幾個(gè)方面進(jìn)行了優(yōu)化。

細(xì)胞培養(yǎng)條件:選擇適合HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基。

轉(zhuǎn)染試劑篩選:測(cè)試多款轉(zhuǎn)染試劑,選擇其中一種轉(zhuǎn)染效果佳的,進(jìn)一步優(yōu)化其轉(zhuǎn)染方案。

質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度:使用高質(zhì)量的質(zhì)粒提取試劑盒和試劑,確保質(zhì)粒的純度和完整性。通過(guò)濃度梯度的實(shí)驗(yàn),測(cè)試了轉(zhuǎn)染試劑(μL)與質(zhì)粒(μg)的不同比例(1:1,2:1,3:1,4:1,5:1),觀察不同比例下轉(zhuǎn)染Hep G2細(xì)胞的綠色熒光蛋白(EGFP)表達(dá)效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)粒比例為2:1(如圖1)。

轉(zhuǎn)染復(fù)合物孵育時(shí)間和孵育溫度:設(shè)置了不同的孵育時(shí)間和溫度梯度,觀察其對(duì)轉(zhuǎn)染效率的影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染復(fù)合物在室溫(20-25℃)孵育20 min時(shí),轉(zhuǎn)染效果優(yōu)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)過(guò)一系列的優(yōu)化實(shí)驗(yàn),Hep G2轉(zhuǎn)染效率顯著提高。60%以上細(xì)胞表達(dá)了熒光蛋白,實(shí)現(xiàn)了熒光蛋白基因在Hep G2細(xì)胞中的高效表達(dá)(如圖2)。

轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)粒不同比例下Hep G2細(xì)胞的熒光蛋白表達(dá)效果

圖1. 轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)粒不同比例下Hep G2細(xì)胞的熒光蛋白表達(dá)效果

用EGFP表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hep G2細(xì)胞48 小時(shí)后的熒光蛋白表達(dá)效果圖
流式檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率

圖2. 用EGFP表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hep G2細(xì)胞48 小時(shí)后的熒光蛋白表達(dá)效果(A:白光圖,B:熒光圖,C:流式檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率)

 

 

 

 

細(xì)胞轉(zhuǎn)染注意事項(xiàng)

 

細(xì)胞狀態(tài)

細(xì)胞狀態(tài)是影響轉(zhuǎn)染效率的關(guān)鍵因素之一。應(yīng)確保使用處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期且活力良好的細(xì)胞,避免使用傳代次數(shù)過(guò)多或受污染的細(xì)胞。

核酸的質(zhì)量和純度

核酸的質(zhì)量和純度對(duì)轉(zhuǎn)染效果至關(guān)重要,應(yīng)使用無(wú)內(nèi)毒素的高純度核酸。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件時(shí),建議設(shè)置空載體對(duì)照、未轉(zhuǎn)染組及陽(yáng)性對(duì)照組,以排除干擾因素,確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

細(xì)胞類(lèi)型和轉(zhuǎn)染條件

不同細(xì)胞類(lèi)型對(duì)轉(zhuǎn)染方法和條件的要求不同,需根據(jù)具體細(xì)胞類(lèi)型和實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行調(diào)整。

 

 

 

 

 

希望這篇關(guān)于細(xì)胞轉(zhuǎn)染條件優(yōu)化的詳細(xì)解析能幫助您提升細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率!更多細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)干貨,請(qǐng)持續(xù)關(guān)注細(xì)胞學(xué)堂專(zhuān)欄~

 

 

 

參考文獻(xiàn)

[1] 

Fus-Kujawa A, Prus P, Bajdak-Rusinek K, Teper P, Gawron K, Kowalczuk A, Sieron AL. An overview of methods and tools for transfection of eukaryotic cells in vitro. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 2021 Jul 20; 9: 701031. 

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Zhi D, Bai Y, Yang J, Cui S, Zhao Y, Chen H, Zhang S. A review on cationic lipids with different linkers for gene delivery. Advances in Colloid and Interface Science. 2018 Mar; 253: 117-140.

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Paecharoenchai O, Niyomtham N, Apirakaramwong A, Ngawhirunpat T, Rojanarata T, Yingyongnarongkul BE, Opanasopit P. Structure relationship of cationic lipids on gene transfection mediated by cationic liposomes. AAPS PharmSciTech. 2012 Dec; 13 (4): 1302-8. 

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O'Brien JA, Lummis SC. Nano-biolistics: a method of biolistic transfection of cells and tissues using a gene gun with novel nanometer-sized projectiles. BMC Biotechnology. 2011 Jun 10; 11: 66.

[6] 

Gödecke N, Hauser H, Wirth D. Stable expression by lentiviral transduction of cells. Methods in Molecular Biology. 2024; 2810: 147-159.

 

 

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